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PCR反应的原理

PCR技术是一种在体外模拟DNA复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据DNA的半保留复制， 以及 DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度， 使双链DNA变性， 成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA， 实现DNA的扩增。

PCR三个基本反应步骤构成，即变性、 退火、 引物延伸。

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，模板DNA双链或经pcr扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

 

实时荧光定量PCR技术原理

实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图( 如图1) 。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value ）（如图2 所示）。

图2. 荧光定量标准曲线

CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct 值。因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光探针和荧光染料

实时荧光定量PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

1．SYBR Green I

图3 SYBR GREEN I 工作原理

SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA 结合染料。与双链DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm ，发射波长最大约为520nm 。 在PCR 反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。

SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I 与所有的双链DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1 。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I 得到定量结果。

2．分子信标（molecular beacon）

图4. 分子信标工作原理
分子信标是一种在靶DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于"黑色" 淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图4 ）。

3．TaqMan 探针

图5. Taqman 探针工作原理
TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

4. LUX Primers

图6.LUX 引物工作原理

LUX(light upon extention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（如图6）。与Taqman 探针和分子信标相比，LUX 引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为LUX 引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。