问题

答案

Q:在预制琼脂糖凝胶中跑电泳时，marker条带跑不开，不清晰，分辨率低，拖尾等现象的解决方案。

1.  拖尾现象产生的一般原因：样品上样量过多，marker量过多。

2.  Marker 分辨率低的主要原因：

Ø  marker 的加样量：marker 有一个推荐浓度范围，选择最高的，样品与Marker含量差别大,也会造成条带错误（这不会是染料的问题，用EB也会存在该问题）。正确的DNA 上样量是条带清晰的保证。Marker 应该选择在目标片段大小附近的梯带较密的，这样比对才准确。另外注意的是，Marker 的电泳条件也要符合DNA 电泳的操作标准: 如果选择λDNA/EcoR I 的酶切marker ，需要预先65℃加热5min ，冰上冷却后使用。从而避免Hind Ⅲ或EcoR I酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

Ø  凝胶不平整：梳子不干净有污染，加样孔不平整也会影响图的效果；

Ø  电泳条件：电压不稳，电泳时间不超过1h。电压过高，会导致小片段跑出胶，出现条带缺失现象。

Ø  缓冲液：TBE的缓冲能力更强，如果缓冲液缓冲性能下降，会导致DNA 电泳条带模糊，不规则迁移等。TAE建议换成TBE 效果更好。另外建议配胶时的缓冲液和电泳缓冲液是同时配制。

Ø  染色剂：GelRed（312nm 激发UV 成像）无毒，性价比高，灵敏度比传统EB高10 倍以上，注意观察凝胶时应根据染料不同，使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带出现模糊等情况。

PS：小片段的DNA 样本，选择浓度百分比大点的gel；但是大浓度的胶对于分子大小相近的DNA 条带不易分辨，容易造成条带缺失现象；大片段的DNA 样本，则选浓度百分比小点的gel，这样跑出的图分辨率高。

3.  Marker 跑不开：凝胶的浓度适当调低；电泳时间延长；电压稍微调高点。

经过比对多家的maker 产品，证实Invitrogen's 1kb Plus DNA Ladder 与Gel Red匹配度最好。

Gel Red比EB分子大（也是由于大分子特性，所以不会透过细胞膜进入人体产生伤害，染料的结合原理都是一样的）。大分子的染料在预制胶中对DNA的迁移有一定影响，但是不确定对哪种类型的DNA 迁移影响严重。采用后染法，不会破坏胶中的DNA 样本，保证了DNA迁移的真实水平。不同于EB，你不用在对染后的胶进行脱色。

针对预制胶电泳拖带、不清晰的建议：

1. 鉴于GelRed 的高灵敏性，建议减少DNA 的上样量。

2. 建议把GelRed再稀释一倍后使用，但过低会影响结果的灵敏性。

3. 用1XTBE缓冲液代替TAE，因为含硼酸盐的试剂导电性能更好。

Q: 拖尾或微笑的DNA条带或错误的DNA迁移条带?

A: 许多客户为方便使用GelRed预制凝胶。但GelRed和GelGreen 是为安全而设计的分子量较大的高效亲和型染料，在预制凝胶电泳中它们可以影响DNA的迁移。如一些限制性酶切的DNA 样本，可能会在GelRed预制凝胶中异常迁移。下列建议可能会提高预制凝胶中的条带分离效果。

1．减少DNA上样量。污染和微笑条带往往是过量的DNA 样本造成的。推荐的泳道和已知浓度的样品的上样量为50-200ng/泳道。对于未知浓度的样品，尝试1/2或1/3的常用上样量

2．减少GelRed在凝胶中的总量，比如用0.5X的浓度来代替1X的浓度。

3．配制百分比浓度小的琼脂糖凝胶。高分子量的DNA 在低百分比的琼脂糖凝胶分离效果比较好。

4．更换电泳缓冲液。TBE 缓冲液比TAE缓冲液的效果更好。

5．为了避免染料可能对DNA 迁移的干扰，我们建议使用电泳后染胶。如果跑胶程序需要的上样量超过推荐量，建议使用电泳后染色法。

Q：荧光弱，时间久染料性能降低，或使用后染法染料仍然在琼脂糖凝胶中。

A : 染料可能从溶液中沉淀。

1．加热GelRed至45-50℃，2min，搅拌溶解。

2．染料在室温下储存，以避免沉淀。

Q: 后染法需要去除染料的步骤吗？

A: 不需要，不过高背景的结果可以考虑适当脱色步骤

Q：GelRed和GelGreen可以用来染色单链DNA或RNA吗？

A: GelRed和GelGreen可用于单链DNA和RNA的染色，但GelRed染单链核酸效果比GelGreen 敏感5倍左右。使用荧光酶标仪的滴定实验表明，GelRed绑定单链DNA和RNA荧光信号约是结合双链DNA 的一半左右。

Q：用哪些仪器检测GelRed和GelGreen？

A: GelRed完美兼容标准（302或312nm）紫外透射成像仪。

GelGreen的吸光度在250-300nm和吸收峰在500nm左右。GelGreen 兼容254nm的紫外透射或可见光激发的凝胶成像仪，如Dark Reader或488nm凝胶激光扫描仪。

Q：什么样的发射滤波片适合使用GelRed和GelGreen？

A: GelRed使用溴化乙锭滤片; GelGreen使用SYBR Green或黄色滤片。另外，长通道黄色滤片可用于GelRed 或GelGreen。请查阅GelRed和GelGreen 更多的特定波长的发射光谱。

Q：GelRed/GelGreen 在熔化的琼脂糖中稳定么？可以将GelRed/GelGreen 储存在熔化的琼脂糖胶中，到用的时候在制备凝胶吗？

A: GelRed比GelGreen更加稳定。但我们不建议将GelRed放在熔化的琼脂糖中存放几天。

Q: GelRed/GelGreen的预制凝胶可以重复使用吗？

A: 不可以，我们不建议GelRed/GelGreen凝胶电泳后重复使用，因为连续电泳会减少染色强度。

Q: 可以重新融化GelRed/GelGreen 凝胶，再制备吗？

A: 是的，但最好再添加一些染料，保证重新制备凝胶的信号强度。

Q：GelRed和GelGreen 用后应该如何处置？

A: GelRed和GelGreen 通过EPA环保监管局22个指标测试。GelRed 和GelGreen 已经被相关部门批准，可以直接倾倒入下水道。然而，由于地方规定的差异，您可以请联系您当地的安全监管部门，获取相关条例。详情请查阅GelRed/GelGreen 安全报告信息。

Q: GelRed及GelGreen与如克隆，连接和测序的下游扩增子兼容吗？

A: 可以。我们建议使用Qiagen公司或Zymoclean 凝胶提取试剂盒，EXO-SAP方案，或酚氯仿抽提法去除DNA中的染料成分。由于GelRed/GelGreen与DNA结合比EB 更为紧密，所以需要去除样品DNA中的GelRed/GelGreen染料,保证DNA的后续操作。

Q: GelRed/GelGreen安全性如何？

A: GelRed/GelGreen 经过埃姆斯AMS和相关测试，已经被证明是替代EB和SYBR染料更为安全的产品。不过，请使用这些试剂时，也要遵循实验室安全条例等。

Q: 哪里可以找到GelRed/GelGreen 安全性相关信息？

A: 请访问我们的网站www.biotium.com 下载完整的安全报告。

Q: GelRed/GelGreen 检测下限是什么？

A: GelRed/ GelGreen 是超敏感的染料。有些用户反馈可以检测含量＜0.1ng 的DNA。然而，染色的灵敏度取决于仪器的性能和曝光设置等。

Q: GelRed/GelGreen 的结合机制是什么？

A: GelRed/ GelGreen 作用原理通过静电及电荷相互作用的结合。

Q: GelRed/GelGreen 迁移的方向？

A: GelRed和GelGreen 相比于EB来说，不容易通过凝胶迁移。不需要在电泳缓冲液中添加额外的染料，凝胶也会比EB 染色更均匀。

Q: GelRed/GelGreen需要在黑暗中使用吗？

A: GelRed和GelGreen是稳定的染料。你可以在室内光线下使用。然而，我们建议将染料储存于黑暗中。

Q: GelRed/GelGreen电泳后染色可重复使用吗？

A: 可以。但如果敏感度降低，则建议更换新鲜的染料溶液。

Q: GelRed 可以被用于凝胶迁移电泳分析和脉冲凝胶电泳吗？

A: 可以。GelRed可用于EMSA和PFGE凝胶的电泳后染色。

Q: GelRed/GelGreen 可以被用于Southern或Northern杂交吗？它会干扰转膜或杂交过程吗？

A: GelRed 可被用于Southern杂交。我们建议使用后染法。

Q: GelRed 可以被用于基于甲醛的RNA凝胶中？

A: 可以。

Q: GelRed可以被用于聚丙烯酰胺，DGGE技术，EMSA实验或PFGE（脉冲场）凝胶吗？

A: 可以。请使后染法。

Q: GelRed可以被用于彗星试验(单细胞凝胶电泳测定技术，它是一种敏感单链或双链DNA突变和破损的遗传测定方法)？

A: 是。

Q: GelRed 是否用于碱性凝胶电泳缓冲液（30MM 的NaOH，1mM 的EDTA）？

A: 是。

Q: GelRed 可被用于氯化铯梯度纯化的DNA 染色吗？

A: 客户使用的结果显示可以。为了去除氯化铯梯度纯化的DNA 中的GelRed，我们建议正丁醇萃取前添加SDS至终浓度0.1％。

Q: 建议用什么方案去除电泳后胶中的GelGreen/GelRed 染料？

A: 客户报告中提到使用Zymo Research 公司的ZymoClean 凝胶DNA 回收试剂盒，USB/Affymetrix 公司的ExoSap-It 试剂盒、Sigma 的GenElute 琼脂糖柱。Life Technologies 公司的PureLink 快速凝胶回收试剂盒，GE Healthcare 公司的Illustra GFX PCR DNA 和凝胶条带纯化试剂盒、Roche 应用科学公司的高纯度PCR产物纯化试剂盒。

Q: 为什么有GelRed 和GelGreen 两种溶剂（二甲基亚砜DMSO 和水）？在DMSO 和水中的染料是否存在差异？

A: 水溶解的产品相对于储存在DMSO 中，是一个全新的改良。由于DMSO 会被皮肤吸收，我们建议染料溶于水，以避免处理二甲基亚砜存在的潜在危害。鉴于有些用户不希望改变实验方案，我们将继续提供储存在DMSO 的染料。经过内部测试，两种溶剂方案的效果相似。

GelRed™ 和GelGreen™的区别？我应该选哪个？

GelRed和GelGreen主要区别荧光激发和吸收波长不同。GelRed 是红色荧光，类似EB。GelGreen是绿色荧光，类似SYBR® Green 或SYBR® Safe。两种染料均可使用标准UV透射光源。GelGreen 同样可以使用蓝色透射光源，避免用户自身和他们的DNA暴露在紫外光下。GelRed和GelGreen对双链核酸比单链核酸的灵敏度高，但是GelRed对于单链核酸比GelGreen 更加灵敏。GelRed对双链核酸的灵敏度是单链核酸的两倍，对于单链核酸GelRed是GelGreen 的5倍。

如何使用GelRed™ 和GelGreen™?

GelRed™/GelGreen™可以染多少胶?

GelRed和GelGreen 加入浓度1X的预制琼脂糖凝胶，或3X终浓度用于电泳后凝胶染色。10,000×储备液用于1X 预制凝胶使用量1:10000（例如，5 uL 用于50ml凝胶），或1:3333比例用于电泳后染色（15 uL用于50 mL溶液）

0.5 mL GelRed或GelGreen 用于制备100个微型凝胶(每块胶50 mL) 使用预制胶的步骤，电泳后染色每块胶50ml染色液，可用于33块胶。后染色的染色液可重复用于两块或更多块胶的染色。

我应该加多少GelRed 或GelGreen到我的6X DNA loading buffer？

我们不建议将GelRed™ 或GelGreen™直接加到loading buffer中，因为这样会使条带迁移不准确。尽管Biotium 提供 6X GelRed™ 预染Loading Buffers，但是我们不建议当您需要测定准确DNA条带大小时使用。为了精确测定DNA条带大小，我们建议使用GelRed™后染色。

后染需要脱色吗？

不需要，但是如果背景比较深的话可以用水使其脱色

GelRed 和GelGreen用什么DNA ladders和loading buffers?

我们用GelRed™和GelGreen™检测了不同供应商的多种DNA ladder，结果都很好。同样，任何普通的DNA loading buffer都可以用。通常条带迁移问题或拖尾或微笑DNA条带都是由于ladder过量。如果您有过条带迁移的问题，请减少ladder的上样量。我们建议GelRed™ 或GelGreen™的预制胶，每个孔ladder的上样量在50-200 ng。Biotium还提供1 kb和100 bp DNA ladders（TE buffer）或随时可用模式的ladders。Ladders用一个单独的6X DNA Loading Buffer管提供，用于您样本的检测。

可以提前制作GelRed/GelGreen凝胶，储存供以后使用吗？

你可以储存预制的GelRed凝胶一周，GelGreen凝胶一个月。我们建议在室温避光条件下储存凝胶。我们不再推荐在4°C储存凝胶，因为这样会导致染料沉淀和表现不佳。

GelRed™/GelGreen™ 向哪个方向迁移?

GelRed 和GelGreen不像EB容易通过凝胶迁移

产品偶然遗忘在室温或暴露在光下，会损坏吗？

大部分Biotium的产品在室温可以稳定保存数天，产品仍然能够很好的工作。为了保险起见，在您使用大量样本或珍贵样本之前，我们建议您进行一个小规模的阳性对照实验，确认产品在您的应用下仍然能够正常工作。

GelGreen™比较例外，它对光比我们大部分其他的荧光染料更加敏感。如果GelGreen™暴露在环境光照下一段时间（几天到几周），它的颜色会从暗橘色变到砖红色。如果发生这种情况，GelGreen™不能用于凝胶染色了。

GelRed™是否可用于在预制胶中检测ssDNA?

可以，请参照 Ana. Biochem. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2012.09.003

GelRed™ 是否可用于Loop-介导的恒温扩增分析?

可以，请参照  Virol J. 2012, 9, 110.

GelRed™/GelGreen™是否可以用于聚丙烯酰胺凝胶DNA染色？

是，聚丙烯酰胺凝胶使用后染色。聚丙烯酰胺凝胶包含3.5-10% 丙烯酰胺，染色时间30 min到1 h，更高的丙烯酰胺含量需要更长的染色时间。

Biotium提供PAGE GelRed™和 PAGE GelGreen™，无毒无诱变性染料，设计用于聚丙烯酰胺凝胶DNA染色。